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液質(zhì)�(lián)�
閱讀�4332時間�2018-05-07 10:27:12

液質(zhì)�(lián)用(HLPC-MS)又稱液相色�-�(zhì)譜聯(lián)用技�(shù),它以液相色譜作為分離系�(tǒng),質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在�(zhì)譜部分和流動相分�,被離子化后,經(jīng)�(zhì)譜的�(zhì)量分析器將離子碎片按�(zhì)量數(shù)分開,經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖�

意義

  色譜的優(yōu)勢在于分�,為混合物的分離提供了最有效的選擇,但其難以得到物質(zhì)的結(jié)�(gòu)信息,主要依靠與�(biāo)�(zhǔn)物對比來判斷未知�,對無紫外吸收化合物的檢測還要通過其它途徑�(jìn)行分�。質(zhì)譜能夠提供物�(zhì)的結(jié)�(gòu)信息,用樣量也非常少,但其分析的樣品需要�(jìn)行純�,具有一定的純度之后才可以直接�(jìn)行分析。因�,人們期望將色譜與質(zhì)譜聯(lián)接起來使用以彌補(bǔ)這兩種儀器各自的缺點(diǎn)�
  �(jù)�(tǒng)�(jì),已知化合物中約80%的化合物是親水性強(qiáng)、揮�(fā)性低的有�(jī)物,熱不�(wěn)定化合物及生物大分子,這些化合物的分析不適宜用氣相色譜分析,只能依靠液相色�。如果能成功地將液相與質(zhì)譜聯(lián)接使用,這一技�(shù)將在生物、醫(yī)�、化工和�(huán)境等�(lǐng)域大有應(yīng)用前景。為�(dá)到這一目的需要一個起“接口”作用的裝置將液相與�(zhì)譜聯(lián)接起��
  這個接口要解決三個主要的問題�
  �1)液相色譜中使用的流速較�,而質(zhì)譜需要一個高真空�(huán)境工��
 ?�?)要從流動相中提供足夠的離子供質(zhì)譜分析;
 ?�?)去除流動相中雜�(zhì)對質(zhì)譜可能造成的污��
  近年�,液相色�-�(zhì)譜聯(lián)用在技�(shù)及應(yīng)用方面取得了很大�(jìn)�,在�(huán)�、醫(yī)藥研究的各領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛,且隨著�(xiàn)代化高新技�(shù)的不斷發(fā)展及液相色譜�(zhì)譜聯(lián)用技�(shù)自身的優(yōu)�(diǎn),液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技�(shù)必將在未來幾年不斷發(fā)展且�(fā)揮越來越重要的作��

特點(diǎn)

  HLPC-MS除了可以分析氣相色譜-�(zhì)譜(GC-MS)所不能分析的強(qiáng)極�、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之�,還具有以下幾個方面的�(yōu)�(diǎn)�
  ①分析范圍廣,MS幾乎可以檢測所有的化合物,比較容易地解決了分析熱不�(wěn)定化合物的難��
 ?、诜蛛x能力�(qiáng),即使被分析混合物在色譜上沒有完全分離開,但通過MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來�(jìn)行定性定��
 ?、鄱ㄐ苑治鼋Y(jié)果可�,可以同時給出每一個組分的分子量和豐富的結(jié)�(gòu)信息�
  ④檢測限�,MS具備高靈敏度,通過選擇離子檢測(SIM)方�,其檢測能力還可以提高一個數(shù)量級以上�
 ?、莘治鰰r間快,HPLC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱,縮短了分析時間,提高了分離效果�
  ⑥自動化程度�,HPLC-MS具有高度的自動化�

接口”技�(shù)的發(fā)�

  �20世紀(jì)70年代�,人們開始致力于�-�(zhì)�(lián)用接口技�(shù)的研究。在開始�20年中處于緩慢的發(fā)展階�,研制出了許多種�(lián)用接口,但均沒有�(yīng)用于商業(yè)化生�(chǎn)。直到大氣壓離子化(atmospheric-pressureionization,API)接口技�(shù)的問�,液-�(zhì)�(lián)用才得到迅猛�(fā)�,廣泛應(yīng)用于�(shí)�(yàn)室內(nèi)分析和應(yīng)用領(lǐng)��
  �-�(zhì)�(lián)用接口技�(shù)主要是沿著三個分支發(fā)展的�
 ?�?)流動相�(jìn)入質(zhì)譜直接離子化,形成了連續(xù)流動快原子轟擊(continuous-flowfastatombombarment,CFFAB)技�(shù)��
 ?�?)流動相霧化后除去溶�,分析物蒸發(fā)后再離子�,形成了“傳送帶式”接口(moving-beltinterface)和離子束接口(particle-beaminterface)等�
  �3)流動相霧化后形成的小液滴解溶劑�,氣相離子化或者離子蒸�(fā)后再離子�,形成了熱噴霧接口(thermosprayinterface�、大氣壓化學(xué)離子化(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)和電噴霧離子化(electrosprayionization,ESI)技�(shù)�。有�(guān)液相�(zhì)譜的接口技�(shù)和LC-MS技�(shù)的發(fā)�,Niessen曾經(jīng)�(jìn)行了較為詳細(xì)的綜��
  1、液體直接導(dǎo)入接�
  1972�,Tal’roze等人提出了直接將色譜柱出口導(dǎo)入質(zhì)譜的思想,當(dāng)時稱之為毛細(xì)管入口界�。相繼有許多研究組開展這方面的研究,在1980年這種液質(zhì)接口已經(jīng)用于商業(yè)化生�(chǎn)。為了避免非揮發(fā)溶劑的污�,Melera使用一個小的橫隔膜對這一接口�(jìn)行了改�(jìn),研制成了液體直接導(dǎo)入接口(directliquidintroductioninterface)技�(shù)。該接口是將液相色譜的流動相沿著�(jìn)樣桿流動,然后通過一個直徑為3-5?m的針�,使液體射入�(zhì)譜計(jì)的CI離子源中。采用傳�(tǒng)的CI離子源可以很容易地把色譜與質(zhì)譜計(jì)相連或脫開�
  液體直接�(dǎo)入接口的�(yōu)�(diǎn)是:接口簡單,造價(jià)低廉,可將非揮發(fā)性和熱不�(wěn)定性的化合物溫和地�(zhuǎn)化成氣態(tài),樣品以溶液狀�(tài)�(jìn)入質(zhì)譜形成了CI條件,可得到分子量信息。缺�(diǎn)是:分流過程中需要減少大量的流動�,使用的隔膜�(jīng)常堵塞�
  2、連續(xù)流動快原子轟�
  1985�1986�,快原子轟擊(FAB)和連續(xù)流動快原子轟擊(CFFAB)接口技�(shù)相繼問世,并隨后投入了商�(yè)化生�(chǎn)??煸愚Z擊是用加速的中性原子(快原子)撞擊以甘油調(diào)和后涂在金屬表面的有�(jī)物(“靶面”),導(dǎo)致這些有機(jī)化合物的電離。分析物�(jīng)中性原子的撞擊獲取足夠的動能以離子或中性分子的形式由靶面逸出,�(jìn)入氣相,�(chǎn)生的離子一般是�(zhǔn)分子離子。在此基�(chǔ)上發(fā)展的連續(xù)流動快原子轟擊技�(shù),得到更廣泛的應(yīng)�。其甘油的濃度在2%-5%之間,比靜態(tài)的FAB使用的甘油量�,且測定過程中“靶面”得到不斷更�,其化學(xué)物理性質(zhì)變化很小,同時經(jīng)色譜分離后的共存物質(zhì)不會同時出現(xiàn)在“靶面”上,因此大大降低了噪聲,信噪比提高,定量分析的重現(xiàn)性也得到改善�
  連續(xù)流動快原子轟擊接口的�(yōu)�(diǎn):是一種“軟”離子化技�(shù),適用于分析熱不�(wěn)�、難以汽化的化合�,尤其是對肽類和蛋白�(zhì)的分析在�(dāng)時是最有效的。缺�(diǎn)是:只能在較低的流量下工�,一般小�5?l/min,大大限制了液相柱的分離效果,流動相中使用的甘油會使離子源很快變臟,同時容易堵塞毛細(xì)�,混合物樣品中共存物�(zhì)的干擾也會抑制分析物的離子化,降低靈敏度�
  3、“傳送帶式”接�
  1977�,世界上臺商�(yè)化生�(chǎn)的液-�(zhì)�(lián)用接口就是使用傳送帶式(moving-belt,MB)技�(shù),是由MacFadden等人對前人研制的傳送線式接口技�(shù)的改�(jìn)。該接口是液相的流動相不停地由傳送帶送入�(zhì)譜離子源,傳送帶可根�(jù)流動相的組成�(jìn)行調(diào)�。在傳送過程中,樣品閃蒸解離�(jìn)入離子源,在�(jìn)入離子源前通過兩個不同的泵和真空閥在減壓條件下加熱除去流動相,可以連接EI、CI或FAB。在分析未知化合物時,可連接EI分析,獲得的譜圖可以在質(zhì)譜數(shù)�(jù)庫檢�。分析大分子生物樣品�,多選用FAB。在CI條件下,�(dāng)樣品與CI等離子體完全接觸的狀�(tài)下才可獲得結(jié)��
  傳送帶式接口的�(yōu)�(diǎn)是:對揮�(fā)性溶劑的傳送能力高�(dá)1.5ml/min,對純水會減少至0.5ml/min;噴射裝置與傳送帶表面�45o夾角�,可以改善色譜積分曲線;非揮�(fā)性緩沖液可以從傳送帶上除�,可以使用非揮發(fā)性緩沖溶液;對樣品的收集率和富集率都較高。缺�(diǎn)是:傳送帶的記憶效�(yīng)不易消除,檢測信號的背景值較�,只能分析熱�(wěn)定性的化合��
  4、離子束接口
  離子束接口(particle-beaminterface,PB)是從單分散氣溶膠界面(monodisperseaerosolgeneratinginterfaceforchromatography,MAGIC)發(fā)展來�。該接口將液相色譜的流動相在常壓下借助氣動霧化�(chǎn)生氣溶膠,氣溶膠�(kuò)展�(jìn)入加熱的去溶劑室,此時待測分子通過一個動量分離器與溶劑分�,然后經(jīng)一根加熱的傳送管�(jìn)入質(zhì)�。分析物粒子在離子源與熱源室的內(nèi)壁碰撞而分�,溶劑蒸�(fā)后釋放出氣態(tài)待測分子即可�(jìn)行離子化�
  離子束接口的�(yōu)�(diǎn)是:分析范圍比熱噴霧接口更寬,將電離過程與溶劑分離過程分開,更適合于使用不同的流動相,不同的分析物質(zhì);主要用于分析非極性或中等極�,分子量小于1,000的化合物,在藥殘、藥物代謝分�、化工方面曾有許多成功的�(shí)例分�。其缺點(diǎn)是:靈敏度變化范圍大,線性響�(yīng)的濃度范圍較窄,兩種化合物的�(xié)同洗脫會對響�(yīng)�(chǎn)生不可預(yù)測的效應(yīng),使用高速氦氣造價(jià)太高,離子化手段仍然是電子轟�,不適于分析熱不�(wěn)定的化合��
  5、熱噴霧接口
  熱噴霧接口(thermosprayinterface)是�20世紀(jì)70年代中期開始在美國休斯頓大學(xué)�(shí)�(yàn)室立�(xiàng)研究,旨在解決在液相和質(zhì)譜之間傳�1ml/min流速水溶液流動相的難題,可使用EI和CI兩種離子化源。在最初的�(shè)�(jì)中非常復(fù)�,直�1987年后的五年內(nèi)才得到突飛猛�(jìn)的發(fā)�。該接口是將液相色譜的流動相通過一根電阻式加熱毛細(xì)管�(jìn)入一個加熱的離子�,毛�(xì)管內(nèi)徑約0.1mm,比液體直接�(dǎo)入接口的取樣孔大很多。毛�(xì)管的溫度�(diào)節(jié)到溶劑部分蒸�(fā)的程�,產(chǎn)生蒸汽超聲噴射,在含有水溶劑的情況下,噴射中含有夾帶荷電小液滴的霧狀�。由于離子室是加熱的,并由前級真空泵�(yù)抽真�,當(dāng)液滴�(jīng)過離子源時繼�(xù)蒸發(fā)變小,有效地增加了荷電液滴的電場梯度。最終使其成為自由離子而從液滴表面釋放出去,通過取樣錐內(nèi)的小孔離開熱噴霧離子��
  熱噴霧接口的�(yōu)�(diǎn)是:可以減少�(jìn)入質(zhì)譜的溶劑量,對不揮發(fā)的分析物分子也可電離,可以接受的溶劑流量大致范圍�0.5~2.5ml/min,但不允許有不揮�(fā)性緩沖溶液。缺�(diǎn)是:該接口技�(shù)的重�(xiàn)性較�,受溶劑成分、取樣桿溫度及離子源溫度的影�;是一種軟電離技�(shù),在譜圖中只有分子離子峰,碎片非常少;對分析物要求有一定的極性,流動相中要有一定量的水,對熱穩(wěn)定性差的化合物有明顯的分解作用�
  6、電噴霧離子化技�(shù)
  電噴霧(ESI)技�(shù)作為�(zhì)譜的一種�(jìn)樣方法起源于20世紀(jì)60年代末Dole等人的研�,直�1984年Fenn�(shí)�(yàn)組對這一技�(shù)的研究取得了突破性�(jìn)展�1985�,將電噴霧�(jìn)樣與大氣壓離子源成功連接�1987�,Bruins等人�(fā)展了空氣壓輔助電噴霧接口,解決了流量限制問題,隨后臺商業(yè)化生�(chǎn)的帶有API源的�-�(zhì)�(lián)用儀問世。ESI的大�(fā)展主要源自于使用電噴霧離子化蛋白�(zhì)的多電荷離子在四極桿儀器上分析大分子蛋白質(zhì),大大拓寬了分析化合物的分子量范圍�
  ESI源主要由五部分組成:
  �1)流動相�(dǎo)入裝��
 ?�?)真正的大氣壓離子化區(qū)�,通過大氣壓離子化�(chǎn)生離��
 ?�?)離子取樣孔�
  �4)大氣壓到真空的界面�
  �5)離子光�(xué)系統(tǒng),該區(qū)域的離子隨后�(jìn)入質(zhì)量分析器。在ESI�,離子的形成是分析物分子在帶電液滴的不斷收縮過程中噴射出來的,即離子化過程是在液�(tài)下完成的。液相色譜的流動相流入離子源,在�?dú)饬飨缕筮M(jìn)入強(qiáng)電場區(qū)�,強(qiáng)電場形成的庫侖力使小液滴樣品離子化,離子表面的液體借助于逆流加熱的氮?dú)夥肿舆M(jìn)一步蒸�(fā),使分子離子相互排斥形成微小分子離子顆粒。這些離子可能是單電荷或多電荷,取決于分子中酸性或堿性基�(tuán)的體積和�(shù)量�
  電噴霧離子化技�(shù)的突出特�(diǎn)是:可以生成高度帶電的離子而不�(fā)生碎�,可將質(zhì)荷比降低到各種不同類型的�(zhì)量分析器都能檢測的程度,通過檢測帶電狀�(tài)可計(jì)算離子的真實(shí)分子�,同時,解析分子離子的同位素峰也可確定帶電數(shù)和分子量。另�,ESI可以很方便地與其它分離技�(shù)�(lián)接,如液相色�、毛�(xì)管電泳等,可方便地純化樣品用于質(zhì)譜分�。因此在藥殘、藥物代�、蛋白質(zhì)分析、分子生物學(xué)研究等諸多方面得到廣泛的�(yīng)�。其主要�(yōu)�(diǎn)是:離子化效率高;離子化模式�,正�(fù)離子模式均可以分析;對蛋白質(zhì)的分析分子量測定范圍高達(dá)105以上;對熱不�(wěn)定化合物能夠�(chǎn)生高豐度的分子離子峰;可與大流量的液相聯(lián)�(jī)使用;通過�(diào)節(jié)離子源電壓可以控制離子的斷裂,給出結(jié)�(gòu)信息�
  7、大氣壓化學(xué)離子化技�(shù)
  大氣壓化�(xué)離子化(APCI)技�(shù)�(yīng)用于�-�(zhì)�(lián)用儀是由Horning等人�20世紀(jì)70年代初發(fā)明的,直�20世紀(jì)80年代末才真正得到突飛猛�(jìn)的發(fā)�,與ESI源的�(fā)展基本上是同步的。但是APCI技�(shù)不同于傳�(tǒng)的化�(xué)電離接口,它是借助于電暈放電啟動一系列氣相反應(yīng)以完成離子化過程,因此也稱為放電電離或等離子電離。從液相色譜流出的流動相�(jìn)入一具有霧化氣套管的毛細(xì)�,被�?dú)饬黛F�,通過加熱管時被汽�。在加熱管端�(jìn)行電暈放電,溶劑分子被電�,充�(dāng)反應(yīng)�,與樣品氣態(tài)分子碰撞,經(jīng)過復(fù)雜的反應(yīng)后生成準(zhǔn)分子離子。然后經(jīng)篩選狹縫�(jìn)入質(zhì)譜計(jì)。整個電離過程是在大氣壓條件下完成的�
  APCI的優(yōu)�(diǎn)是:形成的是單電荷的�(zhǔn)分子離子,不會發(fā)生ESI過程中因形成多電荷離子而發(fā)生信號重�、降低圖譜清晰度的問題;適應(yīng)高流量的梯度洗脫的流動相;采用電暈放電使流動相離子化,能大大增加離子與樣品分子的碰撞頻率,比化學(xué)電離的靈敏度�3個數(shù)量級;液相色�-大氣壓化�(xué)電離串聯(lián)�(zhì)譜成為精�、細(xì)致分析混合物�(jié)�(gòu)信息的有效技�(shù)�

�(yīng)�

  隨著�(lián)用技�(shù)的日趨完善,HPLC-MS逐漸成為最熱門的分析手段之一。特別是在分子水平上可以�(jìn)行蛋白質(zhì)、多肽、核酸的分子量確�(rèn),氨基酸和堿基對的序列測定及翻譯后的修飾工作等,這在HPLC-MS�(lián)用之前都是難以實(shí)�(xiàn)的。HPLC-MS作為已經(jīng)比較成熟的技�(shù),目前己在生化分�、天然產(chǎn)物分析、藥物和保健食品分析以及�(huán)境污染物分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)��
  1、生化方面的分析中的�(yīng)�
  生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、肽和核�,都以混合物狀�(tài)出現(xiàn),具有強(qiáng)極�,難揮發(fā)�,又具有明顯的熱不穩(wěn)定�,所以用GC-MS來分析生物大分子存在困難,需要經(jīng)過深度降�,并需對降解生物作各種�(fù)雜的衍生化處理。而HPLC能分析強(qiáng)極�、不易揮�(fā)、高分子量及對熱不穩(wěn)定的化合�;MS具有高靈敏度,能在復(fù)雜基�(zhì)中�(jìn)行準(zhǔn)確的化合物的�(yōu)�(diǎn),所以HPLC-MS作為生化分析的一個有力工�,正在得到日益的重視。研究人員利用HPLC-MS技�(shù)在生化方面己�(jīng)有很多應(yīng)��
  2、天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)�
  利用HPLC-MS分析混合樣品,和其他方法相比具有高效快�,靈敏度高,只需品�(jìn)行簡單預(yù)處理或衍生化,尤其適用于含量�、不易分離得到或在分離過程中易的組分。因此HPLC-MS技�(shù)為天然產(chǎn)物研究提供了一個高效、切�(shí)可行的分析途國�(nèi)利用該技�(shù)在天然產(chǎn)物研究中已經(jīng)有很多報(bào)�。如李麗等利用高效液相色�(zhì)譜聯(lián)用技�(shù)研究了朝鮮淫羊蕾中的黃酮類化合物�
  3、藥物和保健食品分析中的�(yīng)�
  �(zhì)譜作為液相色譜的檢測器與紫外和二極管陣列檢測器相比較,兼有鑒定功能和靈敏度高的特�(diǎn)。所以近些年來HPLC-MS己經(jīng)成為藥物分析方面的有利工具。近幾年用HPLC-MS對各種藥物尤其是違禁藥物及其代謝�(chǎn)物的研究國內(nèi)外有大量的文�(xiàn)�(bào)�,如尿中的河豚毒�、抗生素、舒喘寧和血液中的安非他�、奧美拉�、羅呱卡因、氨磺必�、前列腺素EZ以及愛滋病病毒等痕量殘留的分�??梢灶A(yù)�,隨著對HPLC-MS研究的深入和該技�(shù)�(yīng)用的普及,HPLC-MS技�(shù)將成為藥物和保健食品中違禁成分分析中�(fā)揮更大的作用�
  4、環(huán)境分析中的應(yīng)�
  HPLC-MS己經(jīng)在環(huán)境分析中有很多的�(yīng)�,如�(huán)境樣品中的抗生素、多�(huán)芳烴、多氯聯(lián)�、酚類化合物、農(nóng)藥殘留等。尤其是近些�,農(nóng)藥殘留問題一直是個熱門話題。由于農(nóng)藥正向高效和低毒方向�(fā)�,使�(nóng)藥的�(huán)境影響和殘留�(nóng)藥的檢測方法�(fā)生了變化。由于目前低濃度、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定和�(qiáng)極性農(nóng)藥分析方法并不是十分理想,因此發(fā)展高靈敏度的多殘留可靠分析方法己成為�(huán)境分析化�(xué)及農(nóng)�(yè)化學(xué)家的重要�(zhàn)略目�(biāo)。高效液相色譜法彌補(bǔ)了氣相色譜法不宜分析難揮�(fā),熱�(wěn)定性差的物�(zhì)的缺陷,可以直接測定那些難以用GC分析的農(nóng)�。但是常�(guī)檢測器如紫外(UV)及二極管陣列(PAD)等定性能力有限,因而在�(fù)雜環(huán)境樣品痕量分析時的化�(xué)干擾也常影響痕量測定時的�(zhǔn)確�,從而限定了他們在多殘留超痕量分析中的�(yīng)�。自�80年代末大氣壓電離�(zhì)�(APIMS)成功地與HPLC�(lián)用以來,HPLC-MS已經(jīng)在農(nóng)藥殘留分析中占了很重要的地位,成為農(nóng)藥殘留分析最有力的工��

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