色譜柱由柱管、壓�、卡套(密封�(huán)�、篩板(濾片�、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成,壓力不高于70kg/cm2�,也可采用厚壁玻璃或石英�,管�(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效,減小管壁效�(yīng),不銹鋼柱內(nèi)壁多�(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔�,其效果與拋光相�。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭�(nèi)裝有篩板,是燒結(jié)不銹鋼或鈦合�,孔�0.2~20?m(5~10?m),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出�
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩�,尺寸規(guī)格也不同�
?、俪�?guī)分析柱(常量柱),內(nèi)�2~5mm(常�4.6mm,國�(nèi)�4mm�5mm),柱長10~30cm�
?、谡瓘街╪arrowbore,又稱細管徑�、半微柱semi-microcolumn�,內(nèi)�1~2mm,柱�10~20cm�
③毛細管柱(又稱微柱microcolumn�,內(nèi)�0.2~0.5mm�
?、馨胫苽�?,內(nèi)�>5mm�
?、輰嶒炇抑苽�?,內(nèi)�20~40mm,柱�10~30cm�
?、奚a(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達幾十厘�。柱�(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定,目的是為了避免管壁效應(yīng)�
常見的分配柱填料:碳十八�
?。∣DS/C18)、碳八柱(MOS/C8�、碳六柱(Hexyl/C6)�
碳四柱(Butyl/C4�、碳一柱(Methyl/C1�、陰離子交換柱(SAX)�
陽離子交換柱(SCX�、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2��
氰基柱(Cyano/CN/Nitrile�
常見的吸附柱填料:硅膠柱
色譜�
的正確使用和維護十分重要,稍有不慎就會降低柱�、縮短使用壽命甚至損�。在色譜操作過程�,需要注意下列問題,以維護色譜柱�
?、俦苊鈮毫蜏囟鹊募眲∽兓叭魏螜C械震�。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀�;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱�(nèi)填料,因此在�(diào)節(jié)流速時�(yīng)該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩(如前所述)�
?、趹?yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不�(yīng)直接從有機溶劑改�?yōu)槿渴撬粗嗳弧?BR> ?、垡话阏f來色譜柱不能反沖,只有生�(chǎn)者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除去留在柱頭的雜�(zhì)。否則反沖會迅速降低柱��
?、苓x擇使用適宜的流動相(尤其是pH�,以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一�(yù)�,分析柱是鍵合硅膠時,預(yù)柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和�,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解�
?、荼苊鈱⒒|(zhì)�(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱�(nèi),需要對樣品進行�(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護�。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且�(yīng)該經(jīng)常更��
?、藿?jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜�(zhì)。在進行清洗�,對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動相的體積應(yīng)是柱體積�20倍左�,即常規(guī)分析需�50~75ml�
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,然后再以相反順序依次沖�,所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜�(zhì),已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲�、乙�、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗,再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖�,那么可以省略用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜�(zhì),在甲醇(乙腈)沖洗時重�(fù)注射100~200?l四氫呋喃�(shù)次有助于除去強疏水性雜�(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類�。有時也注射二甲亞砜�(shù)�。此�,用乙腈、丙酮和三氟醋酸�0.1%)梯度洗脫能除去蛋白�(zhì)污染�
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗,除去交換性能強的�,然后用水、甲�、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物�、甲�、水依次沖洗�
?、弑4嫔V柱時�(yīng)將柱�(nèi)充滿乙腈或甲�,柱接頭要擰�,防止溶劑揮�(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時��
⑧色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時�(yīng)更換濾片�?qū)⑵淙〕鲞M行清�;另一種可能是大分子進入柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大�
在后兩種情況�(fā)生時,小心擰開柱接頭,用潔凈小鋼將柱頭填料取�1~2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱,壓�,再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,但是很難恢�(fù)到新柱的水平�
柱子失效通常是柱端部�,在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5~30mm�,可以起到保護、延長柱壽命的作�。采用保護柱會損失一定的柱效,這是值得��
通常色譜柱壽命在正確使用時可�2年以�。以硅膠為基�(zhì)的填料,只能在pH2~9范圍�(nèi)使用。柱子使用一段時間后,可能有一些吸附作用強的物�(zhì)保留于柱�,特別是一些有色物�(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍�?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷,使柱效下降,這時也可補加填料使柱效恢�(fù)�
每次工作完后,用洗脫能力強的洗脫液沖�,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時,使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道,不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使�,應(yīng)每隔4~5天開機沖�15分鐘�
一、石墨化碳填�
硅膠的化�(xué)�(wěn)定性較�,僅能在pH=2~8的環(huán)境下工作。但�,在很多場合�,需要使用極端的pH條件。為�,人們曾大力�(fā)展高分子微球、氧化鋁、氧化鋯等化�(xué)�(wěn)定性更好的基質(zhì)材料。但�,很難有一種材料能全面地滿足液相色譜基�(zhì)的要�。例�,高分子微球在有機溶劑中會發(fā)生一些溶脹,因此難以�(yīng)用于以含有機溶劑的流動相進行梯度淋洗的場�;氧化鋁和氧化鋯與硅膠相�,雖然化�(xué)�(wěn)定性較�,但其表面修飾與鍵合比較困難。因�,化�(xué)�(wěn)定性好的碳材料便很自然地被考慮作為色譜填料的基�(zhì)�
碳材料有極好的化�(xué)�(wěn)定�,可耐受寬達pH=1~14的環(huán)�;耐高�,石墨化碳可�3000℃以上的高溫而不受破�;經(jīng)適當加工的碳材料可具有很好的機械強度,具有優(yōu)良的�(dǎo)電�、導(dǎo)熱性及電磁屏蔽特性。更為難能可貴的�,多孔性碳材料以其�(jié)�(gòu)的特點而具有很好的吸附性及選擇�。正是碳材料的這些特�,使人們期待它在色譜領(lǐng)域中能有特殊的用途�
�、貫流色譜填�
貫流色譜�20世紀80年代末至90年代初發(fā)展起來的一種色譜分離新方法。在這種填料�,既有通常的微孔或大孔,例�50~150nm的微�,又有貫穿整個顆粒的,孔徑約600~800nm超大孔存�。這種貫穿的大�,可以允許流動相直接進入填料顆粒的內(nèi)部并貫穿而過。這樣,就相當于極大地降低了填料顆粒的直徑,即以貫穿孔將填料分割成了很多更細小的顆�,在這種小顆粒上的微孔已�(jīng)短到不對傳質(zhì)過程�(gòu)成明顯的阻力。因此,在這種貫流色譜填料�,傳�(zhì)阻力已經(jīng)非常�。同�,貫穿孔�(nèi)流動相的線速度正比于柱子中流動相的速度,即傳質(zhì)過程已由擴散傳質(zhì)�?yōu)閷α鱾髻|(zhì)。這就意味著,在一定范圍內(nèi),及時提高流動相速度,也不會降低柱子的分離效�。由于填料上同時還存在有通常的多孔結(jié)�(gòu),其比表面積并未隨貫穿孔的出�(xiàn)而大幅度降低�
因此,在這種填料上的樣品負載量也不隨流速的增加而減�。再�,填料上600~800nm的貫穿孔,極大地增加了柱子的通透�,使得這種柱子即使工作于很高的流速下,其操作壓力也不需要很高。所�,這種貫流色譜柱可以同時具有高流速、高效率、高樣品負載量和低操作壓力的特點�
�、整體柱
整體柱又稱整體固定相、棒�、連續(xù)床等,是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔�(jié)�(gòu),可根據(jù)需要對整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化,是一種新型的用于分離分析或作為反�(yīng)器的多孔介質(zhì)。通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體�。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成,分離在樣品流經(jīng)孔結(jié)�(gòu)時發(fā)�??梢詼p少路徑的差異和縱向擴��
整體柱的�(yōu)點包括:可以原位制備,省去制備填料和裝柱,也可以同法制成聚合物顆粒后再裝�;聚合物易于制備,柱子的長度和直徑在一定程度上不受限制;聚合反�(yīng)混合物中的單體可以靈活選擇以得到適合的基�(zhì)和性質(zhì);易于在柱衍生化,以得到具有合適性質(zhì)的色譜柱;通過控制聚合反應(yīng)的條件可以優(yōu)化孔的性狀�
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