根據(jù)流動相和固定相相對極性不�,液相色譜分為正相色譜和反相色譜。流動相極性大于固定相極性的情況,稱為反相色�。非極性鍵合相色譜可作反相色譜。在�(xiàn)代液相色譜中應用最廣泛,現(xiàn)代液相色譜分析工作的70%以上是在非極性鍵合固定相上進行的�
反相色譜(RPC)是指利用非極性的反相介質為固定相,極性有機溶劑的水溶液為流動相,根據(jù)溶質極�(疏水�)的差別進行溶質分離與純化的洗脫色譜�。與HIC一樣,RPC中溶質也通過疏水性相互作用分配于固定相表�,但是,RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋,表�(xiàn)出強烈的疏水�。因此,必須用極性有機溶�(如甲�、乙腈等)或其水溶液進行溶質的洗脫分��
溶質在反相介質上的分配系�(shù)取決于溶質的疏水�,一般疏水性越�,分配系�(shù)越大。當固定相一定時,可以通過調節(jié)流動相的組成調整溶質的分配系�(shù)。RPC主要應用于相對分子質量低�5000,特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化,也可以用于蛋白質等生物大分子的分析和純�。由于反相介質表面為強烈疏水�,并且流動相為低極性的有機溶劑,生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活,所以,以回收生物活性蛋白質為目的時,應注意選用適宜的反相介���
反相介質的商品種類繁多,其中代表性的是以硅膠為載�,通過表面鍵合非極性分子層制備。通過控制反應時間和溫�,可獲得性能�(wěn)定的反相介質。在硅膠基質的反相填料中,以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料最為常見,用途最��
RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團,基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分�。在生物大分子分離中,多采用離子強度較低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作為流動相�
(1)柱長
有機小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加.但是柱長增加并不能使蛋白質和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加.它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效��
(2)流動相的流��
有機小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越�,柱子越�,色譜峰的寬度就越大,分辨率就越�。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大�
(3)溫度�
溫度上升,流動相黏度下降,流動速度加快,且流動相與固定相之間的傳質速度加快,使分辨率增�。同�,溫度上�,分子熱運動增加,疏水性作用減�。升高溫度要考慮目標物質的熱�(wěn)定��
(4)流動相組��
流動相的極性越�,溶質的分配系數(shù)越大,洗脫時間越�。RPC多采用降低流動相極�(水含�)的線性梯度洗脫法。水是極性最強的溶劑,在反相色譜中常常和基礎溶劑配合使用,向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑,以得到不同強度的流動相,這些有機溶劑稱為修飾�。反相色譜中最常用的有機溶劑有甲醇和乙�。此外,乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六�(huán)也常被用作修飾劑。有機溶劑梯度的大小也會影響分辨率,一般梯度越?。直媛试酱�?BR> 樣品保留�
反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面�、鍵合相種類和濃度決�,保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大.對于非極性化合物通常遵循以下�(guī)則:(�)非鍵合硅膠《氰�<C1(TMS)<C3<C4<苯基<C8≈C18(�)。溶質保留值與固定相表面積成正�,普通載�(80A°)的比表面積約�250m2/g,�300A°孔徑載體的比表面積約�60m2/g。當其他條件相同�,溶質在300A°孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80A°孔徑色譜柱上保留值的1/4(60�250),小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利于強親水性樣品洗�。樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整,溶劑強度取決于有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度。在反相色譜中,采用高溶劑強�、低極性的流動相時可獲得較低的保留�。固定相的不同也可以導致選擇性發(fā)生變�,氰基柱、苯基柱、C8�、C18柱等的選擇性有很大差異,一般應�(yōu)先考慮C8�、C18柱,然后是氰基柱,再次是苯基��
�(jù)�(tǒng)計,�80%的有機物及無機物可以用高效液相色譜法進行分離.其中反相色譜中的C18柱是高效液相色譜中最為常用的一類色譜柱�
色譜柱是HPLC系統(tǒng)非常關鍵的一部分,隨著色譜技術的�(fā)展,它也不斷地更�?lián)Q�,長度變得越來越�,填料顆粒也越來越細?,F(xiàn)在常用的色譜柱長度在30�250mm,顆粒直徑在1.6�5μm。顆粒類型主要有全多孔和表面多孔,全多孔填料具有更大的柱容量、更多鍵合相選擇的優(yōu)�,表面多孔具有反壓低、峰形好的優(yōu)��
目前最常用的基質是硅膠。以前填料純化技術不是很成熟,十八烷基鍵合到硅膠表面不是很完�,硅膠上總是少量的硅羥基裸露在外�。這樣就造成樣品在進行色譜分離的時候,會吸附或者鍵合在這部分硅羥基�,導致色譜峰拖尾。使用三乙胺作為封尾�,先行與硅羥基吸附,可以使峰型改�,這個三乙胺曾經(jīng)一度成為分析界的寶貝和機密?,F(xiàn)在,制造填料的技術日趨成�,人們已�(jīng)掌握了把這部分剩余未鍵合硅膠也進行鍵合鈍化的技�,這個技術就叫作封尾�
�(xiàn)在每家色譜柱的制造商都有其獨特的鍵合技�,常�(guī)的鍵合基團有C8、C18、苯�、氨�、五氟苯基、氰�、裸硅膠�。以下簡單介紹一下每種色譜柱的適用范��
1、C18柱C18色譜柱是目前最常用、每個實驗室必備的通用型色譜柱。填料是硅膠基質上鍵合十八烷�,有較高的碳含量和較好的疏水�,適用于大多�(shù)化合�,包括非極�、極性小分子及一些多肽及蛋白�。隨著每家色譜柱制造商的研�(fā),C18柱的類型還在不斷增加。適用pH范圍由原來的2�8,發(fā)展到�(xiàn)�1�14,與純水相的兼容性越來越好,某些色譜柱即使長時間使用100%水相,也不會�(fā)生填料疏水塌陷。對于每位實驗人員來�,可供選擇的范圍日趨廣泛�
2、苯基柱苯基柱與C18柱相�,是在硅烷基上鍵合一個苯�(huán)。這造成了對于有些特殊的化合�(如芳香族化合�)在反相保留時與C18有不同的選擇�。在某些條件下,可以將C18無法分離的化合物分離�
3、五氟苯基柱五氟苯基柱的填料顆粒是硅烷基上鍵合一個五氟苯�。與常規(guī)的C18保留機制相似,但提供了不同的分離選擇�,提高了對極性樣品的保留,特別是對鹵族化合物�
4、氨基柱氨基柱是在硅膠的硅羥基上鍵合了酰胺基,屬于HILIC模式的色譜柱,其保留機制比較復雜,主要是液液分配、吸附作�、離子相互作用和親水性保留作用的多模式組合。主要用于分析極性大的化合物,還適合用于糖類化合物的分析,如1�5一脫水葡萄糖醇。主要的�(yōu)點是可以使用高有機相分析反相保留弱的化合�,對質譜離子化有更好的兼容�,提高檢測靈敏度�
5、裸硅膠柱未雜化的硅膠顆粒色譜柱在日常的分析中也常用于液相色譜一質譜�(lián)用方�,硅膠柱與氨基柱有相似的保留基質及優(yōu)�,同屬HILIC模式的色譜柱。主要用于極性化合物的分�,特別是強極性堿性水溶性化合物,如生物堿、腎上腺素系��
在液質聯(lián)用中,一般均使用極性溶劑進行洗脫。反相色譜中洗脫強度順序為:�<甲醇<乙腈<乙醇≈丙�,親水作用色譜中洗脫強度順序為:丙酮<乙腈<乙醇<甲醇<�。�??梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑強度和類型來改善化合物的保留和選擇性�
改變流動相洗脫能力通常會引起保留時間的改變,部分化合物可以此作為改善分離度的手段。但有些化合物通常是結構類似的化合�,不能通過改變溶劑強度而增加分離度,這時改變流動相的組分,例如,調整pH、添加緩沖鹽或離子對試劑可能是個可行的選擇。對于某些不能有效分離的化合�,使用兩種混合溶�(甲醇和乙�)作為有機相,可能會得到不錯的分離效果�
串聯(lián)質譜在使用緩沖鹽時需要考慮是否與質譜兼�,必須使用揮�(fā)性試劑。通常使用甲酸、乙�、氨水作為pH調節(jié)�,甲酸銨、乙酸銨作為緩沖�,三氟乙酸和三乙胺作為離子對試劑。有以下幾點需要注意�
(1)甲酸、乙�、氨水與甲酸銨、乙酸銨一起使用具有的緩沖效率,注意鹽在溶劑中的溶出度,防止析��
(2)在負離子模式下加入酸,會抑制大部分化合物的質譜信號響��
(3)在調節(jié)流動相pH�,必須充分了解所用色譜柱的pH范圍,如超出,將大大降低色譜柱壽��
(4)親水作用色譜一般會使用5�50 mmol/L的鹽,來達到改善峰形和保留的目的�
反相介質性能�(wěn)定。分離效率高,可分離蛋白�、肽、氨基酸、核�、甾�、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質�
例如使用C8和C18改造的硅膠柱的高壓液相來制備和分析四環(huán)素類抗生�,對于四�(huán)素類抗生素來說.用氧化鋁、硅�、離子交換樹脂等來進行制備性分離會顯得極性太�。反相色譜硅膠Lichroprep RP一18和RP一8的發(fā)展提供了一個新的分離介質。應用四�(huán)�、土霉素、金霉甲烯土霉素和強力霉素作材料,用Lichroprep RP一18高效低壓柱,溶劑系統(tǒng)中甲�、乙腈�0.1 mol/L乙二�(pH 3.0)的配比為5�0.5�10,能成功地在這幾種抗生素的混合物中有效地分離出四�(huán)�、金霉素、甲烯土霉素和強力霉��
作為�(chǎn)品純化制備手�,應用反相介質分離,相對價格較高,多限于實訓室規(guī)模的應用,在大規(guī)模工�(yè)生產(chǎn)中應用較��
維庫電子�,電子知識,一查百��
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