DNA芯片技�(shù)是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷�探針,或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面,然后與標(biāo)記的樣品雜交,通過(guò)�(duì)雜交信號(hào)的檢�(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息(基因序列及表�(dá)的信息)。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物,所以稱(chēng)為DNA芯片�
芯片的概念及�(fā)展歷� D NA 芯片 (又�(chēng)基因芯片、生物芯片) 技�(shù)是自 20 世紀(jì) 90 年代初發(fā)展起�(lái)的新� 技�(shù)� 是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針, 有規(guī)律地排列固定于支持物�� 然后與待�(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配�(duì)原理�(jìn)行雜�� 再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)� CCD 成像掃描系統(tǒng)等對(duì)芯片�(jìn)行掃�,并配以�(jì)算機(jī)系統(tǒng)�(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出� 較和檢測(cè),從而迅速得出所要的信息。順�(yīng)上述�(fā)展要求的�(chǎn)物,它的出現(xiàn)為解決此�(lèi)�(wèn)� 提供了光輝的前景。該技�(shù)系利用芯片制造技�(shù),將大量 (通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高� 400� 探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治�?,再與標(biāo)記的樣品分子�(jìn)行雜�,通過(guò)檢測(cè)每�(gè)探針?lè)肿拥?雜交信號(hào)�(qiáng)度�(jìn)而獲取樣品分子的�(shù)量和序列信息� 它可以對(duì)生命科學(xué)與醫(yī)�(xué)中的各種生物 化學(xué)反應(yīng)�(guò)程�(jìn)行集�,從而實(shí)�(xiàn)�(duì)基因、配�、抗原等生物活性物�(zhì)�(jìn)行高效快捷的�(cè)� 和分析。它的出�(xiàn)將給生命科學(xué)、醫(yī)�(xué)、化�(xué)、新藥開(kāi)�(fā)、生物武器戰(zhàn)�(zhēng)、司法鑒�、食� 與環(huán)境監(jiān)督等眾多�(lǐng)域帶�(lái)巨大的革新甚至革��
20 世紀(jì) 80 年代,Ba i ns 等人就曾將短� D NA 片斷固定到支持物�,借助雜交方式 �(jìn)行序列測(cè)�� DNA 芯片從實(shí)�(yàn)室走向產(chǎn)�(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技�(shù)� � 照相平板印刷技�(shù)的有�(jī)�(jié)合以及激光共聚焦顯微技�(shù)的引入, 它使得合�� 固定高密度的 �(shù)以萬(wàn)�(jì)的探�?lè)肿忧�?shí)可行,而且借助激光共聚焦顯微掃描技�(shù)可以�(duì)雜交信號(hào)�(jìn)行實(shí) �(shí)� 靈敏� �(zhǔn)確的檢測(cè)和分析� 1996 �� f yme t r i x 公司成功研制出首批實(shí)� DNA � Af 片和芯片閱讀�,為 DNA 芯片�(chǎn)�(yè)�(kāi)�(chuàng)了先河。DN A 芯片技�(shù)由于同時(shí)將大量探針固� 干支持物�� 所以可以一次性對(duì)樣品大量序列�(jìn)行檢�(cè)和分�� 從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡� � � Sou t he rnb l o t t i ng � No r t he r n b l o t t ing 等) 技�(shù)操作�(fù)�、自�(dòng)化程度低� 操作序列�(shù)量少、檢�(cè)效率低等不足。而且,通過(guò)�(shè)�(jì)不同的探針陣�、使用特定的分析� 法可使該技�(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)�,如基因表達(dá)譜測(cè)�、突變檢�(cè)、多�(tài)性分�、基� 組文�(kù)作圖及雜交測(cè)序等�
根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類(lèi)�
原位合成芯片(synthetic gene chip�
采用顯微光蝕刻等技�(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片�(chēng)為原位合成芯�。這種芯片的集成度教高,可�(dá)10�(wàn)�40�(wàn)�(diǎn)�/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度較�,一般為8�20�(gè)核苷酸殘基(nucleotide,nt�,最�(zhǎng)�50nt,因此需要使用多�(gè)相互重疊的探針片�(jìn)行檢�(cè),才能對(duì)基因�(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定�
DNA微集芯片(DNA microchips�
將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片�(chēng)為DNA微集芯片,又�(chēng)為DNA微集陳列(DNA microarray)。這類(lèi)芯片集成度相�(duì)較低,可�(dá)1�(wàn)�10�(wàn)�(diǎn)�/平方厘米,但使用的探針組的來(lái)源比較靈�,可以是合成的寡核苷酸短片段,也可以是采用來(lái)自基因組的較�(zhǎng)的DNA片段;可以是雙鏈,也可以采用單鏈的DNA或RNA片段,且技�(shù)�(shí)�(xiàn)未受到嚴(yán)格的�(zhuān)利控�,因而近年來(lái)�(fā)展很快。探針的�(zhǎng)度可�(dá)100�500nt�
一、芯片的制備
芯片制備的基本原��
芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的�(zhǔn)備和DNA微集陳列的制備三�(gè)方面�
1.支持物的�(yù)處理
目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩�(lèi):實(shí)性材料和膜性材料。實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要�(jìn)行預(yù)處理,使其表面衍生出羥基、氨基等活性基�(tuán)。在合成寡核苷酸�,這些基因可與光敏材料的光敏保�(hù)基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)而被保護(hù)起來(lái),合成時(shí)在光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán),該活性基�(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化�(xué)反應(yīng)。另一方面,這些活性基�(tuán)可與DNA分子中的羥基等基�(tuán)形成共價(jià)�(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表�。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚�(lài)氨酸�,使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針�
2.原位合成芯片的制�
原位合成芯片是采用顯微光蝕刻(photolithography)技�(shù)或壓電打印(piezoelectric printing)技�(shù),在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制�。顯微光蝕刻技�(shù)也稱(chēng)為光引導(dǎo)聚合技�(shù)(light-directed synthesis),它不僅可用于寡核苷酸的合�,也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技�(shù)(photolithography)與傳統(tǒng)的核�,多肽固相合成技�(shù)相結(jié)合的�(chǎn)物,是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印�(jī)相似,所用的技�(shù)也是常規(guī)的固相合成方��
3.DNA微集陳列的制�
DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式�
二、樣品的�(zhǔn)�
樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和�(biāo)記等�(guò)��
1.樣品的分離純化
主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA,這�(gè)�(guò)程包括細(xì)胞分離,破裂,去蛋白,提取及純化核酸的過(guò)��
2.樣品的�(kuò)�
�(cè)定時(shí)往往需要較多的樣品分子,因此對(duì)于分離獲得的基因組DNA通過(guò)PCR技�(shù)直接�(kuò)增,�(duì)于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)�,制備cDNA�
3.樣品的標(biāo)�
�(biāo)記物主要有熒光分子(cy3、cy5)、生物素以及放射性同位素�。帶有標(biāo)記的dNTP(cy3或cy5-dNTP�32P-dNTP、生物素-dNTP)通過(guò)DNA或cDNA�(kuò)增的�(guò)�,摻入靶分子序列。也可以在制備引物時(shí),摻入標(biāo)記的核苷�,擴(kuò)增靶序列�,使�(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢�(cè)同位素標(biāo)記的樣品�
樣品分子�(biāo)記的�(zhì)量影響芯片檢�(cè)的靈敏度,因�,核酸的提取,反�(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求�(yán)格操�。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)�,而且可以采用雙色,如�(duì)照樣品標(biāo)紅色,待檢樣品標(biāo)綠色,有助于�(jié)果分析與判斷�
�、分子雜�
芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測(cè)樣品(靶序列)與固定在載體表面的探針�(jìn)行的�(fù)雜過(guò)程�
依據(jù)探針�(zhǎng)�、類(lèi)型以及不同的目的,確定溫度、鹽濃度與反�(yīng)�(shí)�。通常采用的條件是�42��50%甲酰��6×SSC�0.5%SDS�5×Denhardt試劑。也可采�65��6×SSC�0.5%SDS�5×Denhardt試劑或�65℃,10%SDS�7%PEG-800�
雜交�(guò)程類(lèi)似Northern或Southern雜交,如封閉液預(yù)雜交、雜�、清洗、干燥與檢測(cè)�
四、檢�(cè)分析
芯片雜交信號(hào)的檢�(cè)可應(yīng)用熒光檢�(cè)�、質(zhì)譜法、化�(xué)�(fā)光法、光�(dǎo)纖維法以及生物傳感器�。其中激光共聚焦熒光檢測(cè)法是最常應(yīng)用的方法:激光從芯片的背面切入,聚焦于芯片與靶溶液的相互作用�,與探針雜交的靶序列�(biāo)記物被激�(fā)�(chǎn)生熒�,經(jīng)�(guò)棱鏡聚焦而被檢測(cè)器檢�(cè)。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配�(duì)雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào),不完全雜交顯示較弱的信�(hào)�
核酸是由核苷�(nucleotide) 按一定次序連接而成的生物有�(jī)高分�。堿基可以分� 5 種堿基,分別為腺嘌呤(adenine ,縮�(xiě)� A) 、胸腺嘧� (thymine ,縮�(xiě)� T) 、尿嘧啶 (uracil ,縮�(xiě)� U) 、胞嘧啶 (cytosine ,縮�(xiě)� C) 和鳥(niǎo)嘌呤(guanine ,縮�(xiě)� G) 。兩 條核苷酸分子鏈能夠通過(guò)連續(xù)的堿基互�(bǔ)相結(jié)�� 而互�(bǔ)方式只能� A �(duì) T� A �(duì) U � C �(duì) G。最常提到的核酸分子� DNA( � A� T� C � G 序列�(gòu)�)� RNA( � A � U� C� G 序列�(gòu)�) ,其� DNA 分子就是通過(guò)這種堿基互補(bǔ)方式形成其穩(wěn)定的雙鏈� 旋結(jié)�(gòu)� DNA 分子鏈上的一些片段能夠以堿基互補(bǔ)的方式將其信息傳遞給 mRNA 分子 (�(chēng)為轉(zhuǎn)�) ,然后通過(guò) mRNA 合成出蛋白質(zhì)(�(chēng)為翻�) ,這些片段被稱(chēng)為基因。如果兩 �(gè)核酸分子的堿基序列不互補(bǔ),那么它們之間的配對(duì)�(jié)�(又稱(chēng)為雜�)就不�(huì)�(fā)�。利用� 種高度的特異�,含有一�(gè)已知基因序列的核酸分子,可被視為一�(gè)分子探針 � 該探針� �(guò)和生物樣品中與之互補(bǔ)的目�(biāo)核酸分子的雜交來(lái)檢測(cè)出相�(yīng)的基因�
核酸芯片,又�(chēng) DNA 芯片或基因芯�,就是把成千上萬(wàn)�(gè)不同序列的核酸探�?lè)�?以點(diǎn)陣的形式固定在芯片表�� 然后和經(jīng)�(guò)熒光�(biāo)記的樣品�(jìn)行雜交反�(yīng)� 在雜交后的清� 步驟�,沒(méi)有和探針�(jié)合上的核酸分子將被去�,而結(jié)合到探針上的目標(biāo)核酸分子,其熒光 �(biāo)記在特定波長(zhǎng)激光激�(fā)下會(huì)�(fā)出熒光信�(hào)� 其信�(hào)�(qiáng)度表征了樣品中被檢測(cè)到的目標(biāo)核酸 分子或基因的總量或濃度� 借助�(zhuān)門(mén)的熒光掃描設(shè)備得到的這樣一張各探針�(diǎn)亮度不相同的 雜交圖譜,經(jīng)�(guò)�(jì)算機(jī)軟件的處�,研究者可以一次獲得樣品中眾多基因的量化分析結(jié)�� 從而迅速地指導(dǎo)與基因有�(guān)的一系列研究�
DNA芯片使用的基本流��
DNA芯片使用包括待測(cè)樣品�(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分析3�(gè)步驟�
1.待測(cè)樣品的準(zhǔn)�
樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和�(biāo)��
首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA,由于目前芯片檢�(cè)儀器的靈敏度有�,要求對(duì)樣品中靶序列�(jìn)行高效而特異地?cái)U(kuò)增。樣品的�(biāo)記主要采用熒光法,也可以用生物素,放射性核素標(biāo)記法�
2.分子雜交
待測(cè)樣品�(jīng)�(kuò)增和�(biāo)記處理后,即可與DNA芯片上的探針陳列�(jìn)行分子雜�。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類(lèi)�,屬�-液雜交。探�?lè)肿庸潭ㄓ谛酒砻妫c位于液相的靶分子�(jìn)行反�(yīng)。芯片雜交的特點(diǎn)是探針的量顯著大于靶基因片段,雜交動(dòng)力學(xué)呈線(xiàn)形關(guān)�。雜交信�(hào)的強(qiáng)弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)�
3.檢測(cè)分析
芯片雜交及清洗后,未雜交分子被清�,帶有熒光標(biāo)記的靶DNA(雜交分子)與其互補(bǔ)的DNA探針形成雜交體,在激光的激�(fā)�,熒光素�(fā)射熒�。以?huà)呙鑳x�(duì)熒光信號(hào)�(jìn)行檢�(cè)和分�,通過(guò)陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出�(lái)�
DNA芯片技�(shù)在醫(yī)�(xué)�(lǐng)域的�(yīng)�
DNA芯片用于基因診斷、DNA序列�(cè)�、臨床藥物篩�、法�(yī)鑒定� 食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)�(cè)等方�。在�(yī)�(xué)�(lǐng)域具有極大的潛力�
1.基因診斷
�(yīng)用DNA芯片技�(shù)可以在DNA水平檢測(cè)與疾病相�(guān)的內(nèi)源性或外源性基�;應(yīng)用表�(dá)芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的�(fā)育階�,正常及病理狀�(tài)基因表達(dá)的差�,也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀�(tài)下表�(dá)的差�,從而為疾病診斷與分�(lèi),病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)�
2.DNA序列�(cè)�
任何�(xiàn)狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基�(shù)固定、錯(cuò)落而且重疊的寡核苷�,如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五�(gè)�(cuò)�(kāi)1�(gè)堿基但是可重�7�(gè)堿基�8體亞序列,當(dāng)然也可以分解�7��9體或其他整數(shù)(n體)亞序列。如果用某種方法�5�(gè)亞序列全部測(cè)定出�(lái),就可以重新組建原來(lái)的核苷酸排列順序。應(yīng)用這一原理,可以合成或�(yīng)用已知序列的所有可能的n體寡核苷�,并將其固定在芯片表面,然后與標(biāo)記的待測(cè)靶序列雜�,經(jīng)�(guò)重新組合,即可得到待�(cè)的DNA序列�
3.臨床藥物篩選
臨床許多�(xì)菌對(duì)藥物具有抗藥�,但是不同的亞型�(duì)同一藥物的敏感性不�。DNA芯片技�(shù)已被用于鑒定�(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相�(guān)性以及HIV�(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相�(guān)性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段�
4.其他�(lǐng)�
法醫(yī)鑒定、食品工�(yè)、環(huán)境監(jiān)�(cè)等方�,DNA芯片技�(shù)也將具有極大的潛��